Ресурсы сайта (1449 работ)
ФС.3.3.1.0012.15 Вакцина брюшнотифозная Ви – полисахаридная
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Вакцина брюшнотифозная ФС.3.3.1.0012.15
Взамен ГФ Х, ст.724,
Ви-полисахаридная ФС 42-60ВС-87
Настоящая фармакопейная статья распространяется на вакцину брюшнотифозную Ви-полисахаридную, представляющая собой раствор капсульного полисахарида, извлеченного из супернатанта культуры Salmonella typhi.
Вакцина брюшнотифозная Ви-полисахаридная предназначена для профилактики брюшного тифа.
Производственный штамм Salmonella typhi должен отвечать следующим требованиям:
Технология получения вакцины брюшнотифозной Ви-полисахаридной предусматривает культивирование производственного штамма (штамма-продуцента) в жидкой синтетической питательной среде; получение биомассы и ее дезактивацию; выделение из полученной биомассы капсульного неочищенного Ви-полисахарида и его лиофилизацию; очистку Ви-полисахарида и лиофилизацию очищенного Ви-антигена; получение готовой формы препарата.
На этапе культивирования используют синтетическую питательную среду. Полученную биомассу контролируют на бактериологическую чистоту и типичность морфологии. Инактивацию проводят фенолом, по окончании процесса оценивают специфическую стерильность биомассы методом посева селективные питательные среды.
Полученную инактивированную культуральную жидкость центрифугируют, супернатант подвергают концентрированию и диализу. Концентрат Ви-антигена лиофилизируют, полученный после лиофилизации неочищенный Ви- полисахарид контролируют по массе и определяют Ви- и О-специфическую активность. Этап очистки предусматривает очистку от нуклеиновых кислот, балластных белков и диализ Ви-антигена.
Лиофильно высушенный препарат очищенного Ви-антигена представляет собой субстанцию для приготовления готовой формы препарата.
СУБСТАНЦИЯ ОЧИЩЕННОГО Ви-АНТИГЕНА
Описание
Белый аморфный порошок.
Подлинность
Оценивается в реакции преципитации в геле по Оухтерлони с монорецепторной Ви-сывороткой (подраздел «Подлинность» раздела «Испытания»). Линия преципитации 0,01 % раствора субстанции должна быть идентичной линии преципитации стандартного образца (СО).
Белок
Не более 1,0 %. Определение проводят по методу Лоури без предварительного осаждения белка в соответствии с ОФС «Определение белка» и ОФС «Определение белка колориметрическим методом (метод Лоури) в иммунобиологических лекарственных препаратах». Субстанцию предварительно растворяют в воде очищенной до концентрации 5,0 мг/мл.
Нуклеиновые кислоты
Не более 2,0 %. Определение проводят в соответствии с ОФС «Определение нуклеиновых кислот по методу Спирина в иммунобиологических лекарственных препаратах». Субстанцию предварительно растворяют в воде очищенной до концентрации 1,0 мг/мл.
О-ацетильные группы
Не менее 2,0 мкмоль/мг. Испытания проводят в соответствии с ОФС «Определение О-ацетильных групп в полисахаридных вакцинах». Субстанцию предварительно растворяют в воде очищенной до концентрации 1,0 мг/мл.
Молекулярные параметры
Не менее 50 % полисахарида должно элюироваться в объеме до коэффициента распределения Kd = 0,25. Определение проводят методом гель-фильтрации с использованием сефарозы. Через колонку длиной около 0,4 м, с внутренним диаметром 9 мм, уравновешенную 0,2 М раствором натрия хлорида пропускают около 0,9 мг полисахарида в объеме 0,5 мл и элюируют со скоростью около 14 мл/ч. Фракции регистрируют с помощью ультрафиолетового детектора при длине волны 206 нм. Выход полисахарида оценивают по площади пиков до и после Кd = 0,25.
Калибрование колонки. Определяют полный (Vt) и свободный (Vo) объемы колонки с помощью калибровочных растворов голубого декстрана и натрия азида в условиях, описанных выше.
Вычисляют объем выхода фракций в мл (Vе), соответствующий Кd = 0,25 по формуле:
где
V0 – свободный объем колонки (объем выхода голубого декстрана), мл;
Vt – общий объем колонки (объем выхода натрия азида), мл;
0,25 – коэффициент распределения вещества (Кd).
Рассчитывают значение Vе в мм по формуле и находят на хроматограмме:
Пики, элюирующиеся до и после Kd = 0,25 (значение Vе на хроматограмме, мм), интегрируют вручную.
Содержание полисахарида (А) в субстанции вакцины, элюированного до Kd = 0,25, выраженное в процентах, определяют по формуле:
где
S1 – площадь пика, элюировавшегося до Кd = 0,25;
S2 – суммарная площадь пиков, элюировавшихся до и после Кd = 0,25.
Определение молекулярных параметров можно проводить с помощью валидированного метода эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в соответствии с ОФС «Высокоэффективная жидкостная хроматография» раздел «Эксклюзионная хроматография».
Примечания.
Растворы для калибрования хроматографической колонки готовят непосредственно перед использованием.
Специфическая активность
Содержание Ви-антигена в субстанции должно быть от 70 до 130 %. Испытания проводят методом ракетного иммуноэлектрофореза (подраздел «Специфическая активность» раздела «Испытания»).
Пирогенность
Субстанция должна быть апирогенной. Испытания проводят в соответствии с ОФС «Пирогенность». Тест — доза 0,025 мкг/мл в 1 мл 0,9 % раствора натрия хлорида на 1,0 кг массы животного.
Аномальная токсичность
Субстанция должна быть нетоксичной. Испытания проводят в соответствии с ОФС «Аномальная токсичность».
Готовят раствор субстанции в концентрации 100,0 мкг в 1,0 мл 0,9 % раствора натрия хлорида. Тест-доза для морских свинок — 1,0 мл испытуемого раствора подкожно, для мышей – 0,5 мл испытуемого раствора внутрибрюшинно.
ИСПЫТАНИЯ
Описание
Бесцветная прозрачная или слегка опалесцирующая жидкость с запахом фенола. Определение проводят органолептически.
Подлинность
Подлинность препарата вакцины оценивают в реакции преципитации в геле по Оухтерлони. Вакцина брюшнотифозная полисахаридная должна давать дугу преципитации, идентичную СО Ви-антигена, с монорецепторной Ви-сывороткой (приготовление сыворотки указывают в нормативной документации).
Для постановки реакции пластиковую или стеклянную пластины размером 8,5 × 9,5 см заливают 12 мл 1 % геля агарозы, приготовленном на 0,9 % растворе натрия хлорида. В застывшем слое геля с помощью пробойника и специального трафарета делают лунки: одну центральную, остальные — на периферии. Диаметр лунок — 0,4 см, расстояние между ними должно быть 0,4 см. В центральную лунку вносят 15 мкл раствора монорецепторной Ви-сыворотки (титр не ниже 1:800), в периферические – по 15 мкл СО и испытуемой вакцины, а также 0,9 % раствор натрия хлорида в качестве отрицательного контроля. Затем пластину помещают во влажную камеру на 24 – 48 ч. Вакцину считают подлинной, если линия преципитации вакцины в отношении монорецепторной Ви-сыворотки идентична линии преципитации СО.
Прозрачность
Прозрачная или опалесцирующая жидкость не более эталона I. Испытания проводят в соответствии с ОФС «Прозрачность и степень мутности жидкостей».
Цветность
Бесцветная жидкость. Определение проводят визуально в соответствии с ОФС «Степень окраски жидкостей».
Механические включения
Видимые механические включения должны соответствовать требованиям ОФС «Видимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения и глазных лекарственных формах».
рН
От 6,7 до 7,3. Определение проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС «Ионометрия».
Извлекаемый объем
Не менее номинального. Испытания проводят в соответствии с ОФС «Извлекаемый объем лекарственных форм для парентерального применения».
Стерильность
Вакцина должна быть стерильна. Испытания проводят методом прямого посева в соответствии с ОФС «Стерильность».
Пирогенность
Вакцина должна быть апирогенной. Испытания проводят в соответствии с ОФС «Пирогенность». Готовят разведение испытуемого образца с помощью апирогенного 0,9 % раствора натрия хлорида до конечной концентрации 0,025 мкг/мл. С этой целью к 0,1 мл испытуемого образца прибавляют 1,9 мл 0,9 % раствора натрия хлорида и перемешивают, затем отбирают 0,1 мл разведенного образца и прибавляют 9,9 мл 0,9 % натрия хлорида. Вводят кроликам из расчета 1 мл испытуемого образца в концентрации 0,025 мкг/мл на 1 кг массы животного.
Аномальная токсичность
Вакцина должна быть нетоксичной. Определение проводят в соответствии с ОФС «Аномальная токсичность». Тест-доза для морских свинок — 1,0 мл подкожно; для мышей – 0,5 мл внутрибрюшинно.
Специфическая активность
Одна доза вакцины должна содержать (25 7,5) мкг Ви-антигена. Определение проводят методом ракетного иммуноэлектрофореза (РИЭФ).
В химическую пробирку с 16 мл расплавленного и охлажденного до температуры 56 °C 1 % геля агарозы вносят 0,5 мл сыворотки против Ви-антигена S.typhi (титр не ниже 1:800) и перемешивают. Содержимое пробирки выливают на стеклянную пластинку размером 6 × 12 см, установленную на горизонтальной поверхности. Пластинка должна покрыться гелем агарозы равномерно и полностью. Толщина геля должна составлять (1,0 ± 0,1) мм. После застывания геля агарозы пластинку накладывают на трафарет и пробивают лунки пробойником диаметром 4 мм, после чего удаляют гель из лунок с помощью вакуумного насоса или иглы.
В катодную и анодную части электрофоретической камеры заливают по 800 мл разведенного трис-боратного буферного раствора (раствор 2) и охлаждают заполненную буферным раствором камеру до температуре 4 °С в холодильной установке. Охлажденную камеру вынимают и помещают в нее пластину таким образом, чтобы край пластины с лунками находился у анодной части.
Электродные мостики для соединения гелевой пластины с буферным раствором готовят из 4 слоев фильтровальной бумаги размером 6 × 12 см. С их помощью соединяют поверхность агарозы с трис-боратным буферным раствором. Расстояние от края мостика до лунок должно быть не менее 15 мм. В лунки последовательно вносят по 15 мкл раствора СО Ви-антигена с концентрацией 5; 10; 15; 20 мкг/мл для построения калибровочного графика и испытуемый образец вакцины, предварительно разведенный в 5 раз. Проводят электрофорез при напряжении 180 –200 В при постоянной силе тока 10 мА в течение 4 ч. Каждую пробу вносят в 2 лунки. Время от начала нанесения образцов до включения прибора не должно превышать 10 мин. Пластинку переносят в кювету с 0,9 % раствором натрия хлорида и выдерживают 15 – 20 ч при температуре 18 – 20 °С для отмывания от сыворотки. После этого пластинку вынимают, накрывают фильтровальной бумагой, прокалывают бумагу иглой над лунками и сушат на воздухе при температуре 18 – 20 °С. После высушивания геля агарозы пластинку с гелем переносят в кювету с красителем на 20– 25 мин, а затем в кювету с раствором для обесцвечивания окрашенных гелей на 15–20 мин, далее промывают в водопроводной воде и сушат при температуре 18 – 20 °С.
По окончании процедуры измеряют высоту пика (h) от края лунки до внешнего края пика. Строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс концентрации Ви-антигена, а по оси ординат — высоту пика («ракеты») СО. По калибровочной кривой находят концентрацию Ви-антигена в испытуемом образце с учетом предварительного разведения. Содержание Ви-антигена (Х) в процентах рассчитывают по формуле:
где:
С – концентрация Ви-антигена в испытуемом образце, найденная по калибровочному графику, с учетом предварительного разведения, мкг/мл;
50 – среднее номинальное значение содержания Ви-антигена в 1 мл анализируемой вакцины, мкг/мл.
Построение калибровочного графика. СО Ви-антигена разводят, исходя из аттестованного значения, до концентрации 20 мкг/мл в соответствии с инструкцией по применению. К 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 мл прибавляют воду очищенную до конечного объема 0,4 мл (концентрация Ви-антигена в полученных растворах 5; 10; 15; 20 мкг/мл соответственно). В пробирку, содержащую 0,4 мл раствора СО, воду очищенную не добавляют. Растворы используют свежеприготовленными.
Примечания.
Фенол
е более 0,75 мг/доза. Испытания проводят в соответствии с ОФС «Количественное определение фенола спектрофотометрическим методом в иммунобиологических лекарственных препаратах».
Упаковка и маркировка
В соответствии сОФС «Иммунобиологические лекарственные препараты». На вторичную упаковку наносится предупредительная надпись: «Для лечебно-профилактических и санитарно-профилактических учреждений».
Транспортирование
При температуре от 2 до 25 °С, допускается транспортирование при температуре 35 °С не более 14 сут.
Хранение
При температуре от 2 до 8 °С.