13. «Плоды», «коры», «семена»: общие приемы и методы макроскопического и микроскопического анализа лекарственного растительного сырья. Люминесцентная микроскопия. Значение анализа.

Fructus –плоды ()

Плодами называют истинные и ложные плоды, соплодия, сбор-ные плоды, а также их части. У плодов устанавливают форму, тип и размеры. Плоды, принадлежащие к сочным, рассматривают сначала в сухом виде, а затем после размачивания в горячей воде или кипя-чения в течение 5-10 минут. Из размоченных плодов вынимают кос-точки или семена, отмывают их от мякоти, изучают их  внешний вид.

У плодов зонтичных определяют, кроме того, количество и характер ребрышек, опушение и специфические признаки. У семян определя-ют форму и внешний вид оболочки  (схема  8).  Для качественных хи-мических реакцийготовят 10% водный отвар плодов.

Cortex –кора

Кора как  лекарственное  сырье представляет  собой  наружную часть стволов, ветвей и корней деревьев и кустарников, расположенную к периферии от камбия.  Макроскопический анализ коры проводят на сухом материале. Определяют форму и размеры кусков коры, обращая особое внимание на ее толщину, так как качество сырья в значительной степени зависит от возраста коры. В сырье кора имеет вид  трубчатых  желобоватых  или  почти  плоских  кусков  различных размеров. Наружная поверхность коры покрыта пробкой.  Обращают внимание  на  цвет  пробки,  характер  поверхности  (гладкая,  морщинистая,  шероховатая),  форму  и  цвет  чечевичек,  наличие  лишайников и т. п. Внутренняя поверхность коры может быть гладкой или ребристой  (что  характерно  для  каждого  вида),  по  цвету  она  более светлая, чем наружная поверхность. Для идентификации коры наряду с характерными признаками поверхности большое значение имеет характер поперечного излома, который зависит от наличия и особенностей строения механических элементов коры. Запах коры определяют  при  разламывании  или  соскабливании  скальпелем.  Для  идентификации коры  важное  значение имеют  качественные  химические реакции, которые проводят как с водным отваром, так и с соскобом или нанося реактив на внутреннюю поверхность коры.

SEMINA – СЕМЕНА Semen – семя Семенами в фармацевтической практике называют цельные семена и отдельные семядоли. Семена собирают, как правило, зрелыми и высушивают. Семена исследуют сухими, рассматривая их невооружённым глазом или с помощью лупы (10×). Диагностическое значение имеют форма, размеры (длина, толщина или поперечник) семени, характер поверхности, цвет, запах и вкус, форма, размеры и расположение зародыша, наличие и форма рубчика или семяшва и т.д. Размеры определяют с помощью измерительной линейки или миллиметровой бумаги, шарообразных семян – просеиванием сквозь сито с круглыми отверстиями. Цвет определяют при дневном освещении, запах – при разламывании или растирании, вкус – пробуя кусочек сухого сырья или его отвар (только у неядовитых объектов).

Приготовление и исследование микропрепаратов из плодов и семян

Цельное,  измельченное,  дробленое   сырье.  При  микроскопическом анализе  плодов и семян рассматривают микропрепараты кожуры с поверхности или поперечные срезы.

Диагностическое  значение  имеет  строение  околоплодника.  В околоплоднике  различают  три  слоя:  наружный  – экзокарпий  (эпидермис), средний  — мезокарпий, внутренний  –эндокарпий. Обращают  внимание  на  форму,  строение  клеток  эпидермиса, на  наличие  и особенности  строения  волосков;  в  мезокарпии  важное  значение имеют  наличие  механических  элементов,  их  форма  и  локализация, число  и  расположение  эфиромасличных  канальцев,  проводящих пучков,  наличие кристаллических  включений,  форма  клеток  паренхимы и др.

У  семян  обращают  внимание  на  общее  строение,  характер  и строение семенной кожуры, величину и форму запасной питательной ткани –эндосперма, форму и строение зародыша.

Для приготовления препаратов кожуры 2-3 семени, плодили его кусочек кипятят в пробирке в растворе 5%  натрия  гидроксида в течение 1-2 мин(при очень темной пигментированной кожуре кипятят дольше  —  до просветления), затем  помещают на предметное стекло, препаровальными  иглами  снимают  отдельные  слои  кожуры  и  рассматривают их в растворе глицерина или хлоралгидрата. Ткани мезокарпия и эндокарпия рассматривают в давленных препаратах и на срезах. Давленные препараты получают при использовании обратного конца препаровальной иглы или скальпеля путем надавливания на объект в заключающей среде на предметном стекле.

Для приготовления срезов слишком сухие плоды и семена предварительно  размягчают,  поместив  их  на  сутки  во  влажную  камеру (влажной  камерой  служит  эксикатор с  водой, в  которую  добавлено несколько капель хлороформа), или в водяных парах, для чего в конической  колбе  кипятят  небольшое  количество  воды,  семена  или плоды  помещают  в  марлю  и  подвешивают  на  стеклянной  палочке так, чтобы они находились в парах, но не погружались в воду. Размягчение продолжают 15-30 мин или более, в зависимости от твердости плодов или семян. После этого приступают к приготовлению срезов.

Мелкие,  плоские  семена,  которые  трудно  удержать  пальцами, режут в пробке, как при подготовке срезов из листьев и трав.

Мелкие,  круглые  или  гладкие  семена,  не  удерживающиеся  в пробке, помещают в парафиновый блок размером 0,5  х  0,5  х  1,5см.

Парафин  расплавляют  с  узкой  стороны  блока  кончиком  нагретой препаровальной  иглы  и в  образовавшуюся  ямку  быстро  погружают семя.  Семя  должно  быть  сухим.  Допускается  предварительно  размягчить семя во влажной камере. Срезы делают бритвой через семя вместе с парафином, помещают на предметное стекло,  удаляют парафин препаровальной иглой или отмывают бензином и рассматривают в растворе хлоралгидрата.

Микропрепараты  порошков  плодов  и  семян готовят  аналогично микропрепаратам порошка листьев, трав и цветков.

При  исследовании  строения  клеток  кожуры  и  околоплодника  в порошке из плодов и семян, содержащих крахмал или незначительное количество жирного масла, препарат готовят в растворе хлоралгидрата при легком подогревании.

При необходимости порошок обезжиривают  и просветляют следующим способом: для обезжиривания порошок сырья помещают в пробирку с притертой пробкой и заливают 2-3 раза смесью спирта с эфиром(1:3) и после настаивания каждый раз в течение 20 мин растворитель сливают. Вместо смеси спирта с эфиром для обезжиривания можно использовать ксилол или эфир.

Для  просветления  0,5-1,0 г  порошка  насыпают  в  фарфоровую чашку, прибавляют 5-10 мл разведенной азотной кислоты и кипятят в течение 1 мин, затем жидкость процеживают через ткань и промывают горячей водой. Остаток на ткани собирают лопаточкой обратно в фарфоровую чашку, обливают 5-10 мл 5% раствора натрия гидроксида,  кипятят  в  течение  1  мин,  снова  процеживают  через  ту  же ткань и промывают горячей водой. Остаток рассматривают в растворе глицерина под микроскопом.

При анализе порошка из плодов и семян проводят качественные реакции для выявления содержимого клеток.

Для  определения  крахмала в  порошке  готовят  два  препарата: один  окрашивают  раствором    Люголя  (раствор  иода  в  водном  растворе  иодистого  калия) и  по  синей  окраске  определяют  наличие крахмала(окраска исчезает при нагревании и со временем, поэтому анализируют  препарат  сразу  после  изготовления).  Второй  препарат помещают  в воду и  определяют форму, строение и величину  крахмальных зерен.

Для  определения  наличия  жирного  масла  и  эфирного  масла  в порошке готовят препарат в растворе Судана  IIIпри подогревании. Капли  масла  окрашиваются  в  оранжево-желтый   или  оранжево-розовый цвет.Для  отличия  эфирных  масел  от  жирных  масел  объекты  погружают в 2-3 капли водного раствора метиленового синего. Через несколько  минут  их  рассматривают  в  воде  или  глицерине.  Эфирное масло окрашивается в синий цвет.

Эфирные масла можно наблюдать без применения красителей в виде капель светло-желтого, темно-желтого, зеленовато-желтого, коричневато-красного цвета.

Для  определения  наличия  слизи в  порошке  препарат  готовят  в растворе  черной  туши  и  тотчас  ставят  под  микроскоп  при  малом увеличении. Слизь заметна в виде бесцветных масс на черном фоне, которые при легком надавливании препаровальной иглой растекаются.

Приготовление и исследование микропрепаратов из коры.

При анализе цельной коры готовят поперечные или продольные срезы. Для размягчения кору ломают на кусочки длиной около 1  -2 см и шириной 0,5  -1 см. и кипятят в пробирке с водой в течение 1-5мин.;  размягченные  кусочки  выравнивают  скальпелем так,  чтобы они имели строго поперечное или продольное сечение. Срезы делают  бритвой,  смачивают  поверхность  коры  раствором  глицерина, снимают  их  кисточкой  и  переносят  на  предметное  стекло.  Тонкие коры режут в пробке, как при подготовке срезов из листьев и трав.При  определении  обращают  внимания  на  наружную  кору,  располагающуюся к периферии от окончания сердцевинных лучей и состоящую  из  первичной  коры  (если  сохранилась)  и  перидермы  и  на внутреннюю  (флоэму)  расположенную  от  камбия  до  окончания сердцевинных лучей (схема 10).

Люминесцентная, или флюоресцентная, микроскопия — метод гистологического анализа с помощью люминесцентного микроскопа, в котором используется явление люминесценции (свечения) веществ при действии на них коротковолновых лучей (ультрафиолетового света, рентгеновских лучей). Некоторые биологические соединения, присутствующие в клетках, характеризуются спонтанной флюоресценцией при попадании на клетку ультрафиолетовых лучей. Для выявления же большинства других соединений клетки обрабатываются специальными флюорохромами (флюо-ресцеином, акридином оранжевым, корифосфином). С помощью флюорохромов исследуют, например, содержание в клетках нуклеиновых кислот. При окраске акридином ДНК дает красно-зеленое свечение, а РНК — оранжевое. Люминесцентный микроскоп широко используется также для изучения иммунофлюоресценции. Иммунофлюоресценция позволяет исследовать в клетке содержание очень малых количеств белка. Препарат предварительно обрабатывают антителами к исследуемому белку, меченными флюоресцирующим красителем.